Spektrenauswertung

Bradyspec
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In Massenspektren bilden sich viele Moleküleigenschaften ab – aber (leider) nicht alle!

  • Die am Besten zu beantwortende Frage ist die nach der Masse einer Verbindung.
  • Dazu gehört auch die Klärung der Elementarzusammensetzung über die Bestimmung der exakten Masse.
  • Gute Chancen bestehen auch, isomere Verbindungen zu unterscheiden, die sich strukturell stark unterscheiden. z.B. alternative Aminosäuresequenzen in Peptiden, Positionsisomerien von funktionellen Gruppen.
  • Wenn strukturelle Änderungen in Bereichen stattfinden, die bei der Fragmentierung nicht beteiligt sind, wird sich das kaum in den Spektren niederschlagen.
  • Manche Strukturisomerien z.B. E/Z, Diastereomerien, optische Isomerien können massenspektrometrisch gar nicht unterschieden werden.

  • Spektreninterpretation

    Die Ausdrucke der gemessen Spektren enthalten viele Informationen. Für ein besseres Verständnis bieten wir eine PDF-Datei mit kommentierten Beispielspektren an.

    Messdiagramme kommentiert (NEU!)

    Interpretation von Massenspektren


    Empfohlene Schritte zur Interpretation eines EI-Spektrums:

    • Berechnung der Molekulargewichte aller in der Reaktion eingesetzten Substanzen und der erwarteten Produkte.
    • Betrachtung des gesammten Spektrums (gibt es viele Signale gleicher Intensität, nur wenig Signale, Serien von Peaks, etc.). Stimmt dies mit der Erwartungshaltung überein?
    • Gibt es eine allgegenwärtige Verunreinigung (Weichmacher, Antioxidans, etc.)?
    • Suche nach Signalen im hohen Massenbereich und versuche das Molekülion zu bestimmen. Kontrolliere ob die ersten Fragmentierungen mögliche und vernünftige Fragmentierungen sind.
    • Häufig ist die Fragmentierung so schnell, dass kein Molekülion zu erkennen ist. Suche dann nach wahrscheinlichen Fragmentierungen (z.B. Verlust von H2O (bei Alkoholen), MeOH (Me-Ester), CH3 (TMS-Gruppe) und viele andere Moleküle mit Methylgruppen).
    • Berücksichtige die Isotopenmuster, besonders das des Molekülions.
    • Versuche einen Zusammenhang zwischen der Fragmentierung und der erwarteten Struktur herzustellen (Massenunterschied, Schlüsselfragmente, etc.).
    • Das Spektrum kann in einer Datenbank (z.B. NIST) gesucht werden, wenn man es nicht findet kann man auch vergleichbare Spektren suchen und mit der Struktur vergleichen.


    Empfohlene Schritte zur Interpretation eines MALDI Spectrums:

    • Welche Matrix wurde benutzt und welche Ionen sind von dieser zu erwarten? Zum Beispiel: DHB m/z 137, 154, 155, 177, 273, 362; DCTB m/z 235, 250, 500, 750, 1000.
    • Berücksichtige die erwartete Struktur. Ist das Produkt basisch (Amine, etc.) erwartet man protonierte Teilchen, hat das Produkt verschiedene funktionelle Gruppen kann man Komplexe mit Natrium und/oder anderen Kationen erwarten; ist das Produkt ein Salz sollte man nach der Kationenmasse suchen. Entsprechendes gilt für negative Ionen.
    • Man kann häufig mehr als ein Pseudomolekularion pro Verbindung beobachten, z.B. [M+H]+ begleitet von [M+Na]+ oder im Negativen [M-H]- und [M+Cl]-.
    • Die Art der Ionisierung wird nicht nur durch die Substanz sondern auch durch die verwendete Matrix und vorhande Salze (pH, Puffersalze) bestimmt.
    • Wenn die Substanz leicht zu oxidieren oder zu reduzieren ist, bilden sich häufig Radikalkationen (oder Anionen) bei der Verwendung von aprotischen Matrizes.
    • Da TOFs (theoretisch) keine Massenbegrenzung nach oben hin haben aber die Auflösung begrenzt ist, kommt es oft dazu, dass die Signale im niedrigen Massenbereich isotopisch aufgelöst werden im hohen Massenbereich aber nicht. Dies muss berücksichtigt werden bei der Berechnung der erwarteten Massen! Die Massengenauigkeit eines TOF Massenspektrometers ist abhängig von seiner Konstruktion und den Messbedingungen. Mit dem Autoflex Speed (oder Reflex IV) ist sie ungefähr ±0,01% der aktuellen Masse.


    Empfohlene Schritte zur Interpretation eines ESI-Spektrums

    • Berücksichtige die erwartete Struktur. Ist das Produkt basisch (Amine, etc.) erwartet man protonierte Teilchen, hat das Produkt verschiedene funktionelle Gruppen kann man Komplexe mit Natrium und/oder anderen Kationen erwarten, ist das Produkt ein Salz sollte man nach der Kationenmasse suchen. Entsprechendes gilt für negative Ionen.
    • Man kann häufig mehr als ein Pseudomolekularion pro Verbindung beobachten, z.B. [M+H]+ und [M+Na]+ oder [M-H]- und [M+Cl]-, [M+Acetat]-, [M+Formiat]-.
    • Die Art der Ionisierung wird nicht nur durch die Substanz sondern auch durch das Lösemittelsystem (pH, Puffersalze) bestimmt; hophe Konzentationen an Puffern oder Salzen müssen unbedingt vermieden werden.
    • Mit der Größe der Moleküle steigt die Chance, dass sich doppelt (mehrfach) geladene Ionen bilden z. B. [M+2H]2+. Diese können durch den Abstand der Isotopenpeaks erkannt werden (1 Da Abstand für einfach geladene Ionen, ½ Da für doppelt geladene und 1/3 Da für dreifach geladene Moleküle, etc.).
    • Häufig teilen sich zwei oder mehr Moleküle ein Kation, diese Strukturen werden meist als "Coulombdimere“ bezeichnet, z.B. [2M+Na]+.
    • Fragmentierungen sind selten bei Standardmessungen, können aber durch Verändern der Bedingungen erzeugt werden (z.B. Erhöhen der Cone-Spannung).

    Mit unserem ESI-spectrometer Quattro LCZ erwarten wir eine Massengenauigkeit von ±0,2 Da im MS-Modus und im MS/MS-Modus sind durchaus ±0,4 Da normal.
    Bei der exakten Massenbestimmung mit dem MicroTof liegt die Genauigkeit bei ±5 mDa, mit der Orbitrap ist sie in der Regel besser als 2 ppm.

    Exakte Massenbestimmung

    Die Massen der reinen Isotope sind nicht ganzzahlig, ausgenommen 12C. Daher unterscheiden sich Kombinationen der Isotopen, mit der gleichen ganzzahligen Masse, in ihrer Nachkommastelle. Ist also die Genauigkeit der Massenbestimmung hoch genug und das Signal wird nicht durch andere überlagert*, kann man zwischen Ionen mit unterschiedlicher Elementarzusammensetzung unterscheiden.
    Beispiel:

     

     N2  28.006148016 Da
     C2H4  28.031300148 Da
     CO  27.994914640 Da

     

    Normalerweise wird bei einer exakten Massenbestimmung ein Fehler von ± 5 mDa oder ± 5ppm (bei Massen > 1000) toleriert.
    Zu beachten ist, dass die Masse eines Elektrons ~0,55 mDa beträgt und bei der Berechnung der exakten Masse von Ionen berücksichtigt werden sollte (Orbitrap, Mictrotof).

    *Gibt es bei einem Peak eine Überlagerung mit einem anderen, so kann die exakte Masse nur bestimmt werden, wenn die Auflösung so weit erhöht wird, dass die beiden Peaks gut voneinander separiert sind. Dies bezeichnet man als "high resolution". Zum Beispiel kann die exacte Masse von N2 bei dem Vorhandensein von CO erst ab einer Auflösung von 4000 genau gemessen werden.

  • Verunreinigungen

    Eine gute Datenbank für Verunreinigungen findet sich auch bei MaConDa (Mass Spectrometry Contaminants Database).

    Elektronenionisation (EI)

    Die Verbindungen sind aufsteigend sortiert nach der exakten Masse des Molkülions bzw. dominantesten Fragmentions.
    m/z Art Summenformel (des Ions) Name und Herkunft
    149.0238  F+  C8H5O3+  Phthalates, especially Di-iso-octylphthalate, Weichmacher
    207.0323  F+  C5H15Si3O3+  Hexamethyltrisiloxan – CH3 Siliconöl 
    281.0511  F+  C7H21Si4O4+  Octamethyltetrasiloxan – CH3 Siliconöl 
    281.2713  M+  C18H35NO+  kleiner Peak, Oleamide, Oleic acid amide, Gleitmittel für Plastik (Spritzen!) 

    F+ = dominantes Fragment
    M+ = Radikalkation

    ESI / MALDI

    Die Verbindungen sind aufsteigend sortiert nach der exakten Masse des Pseudomolekülions.
    m/z Art Summenformel (des Ions) Name und Herkunft
    102.1282  M+H+  C6H15NH+  Triethylamine, Di-isopropylamine 
    130.1590 M+ (C2H5)4N+ Tetraethyl ammonium
    169.0947  2M+Na+  (C3H7NO)2Na+  DMF Coulombdimer 
    172.0944  M+Na+  C6H15NO3Na+  Triethanolamine 
    203.0526  M+Na+  C6H12O6Na+  Hexose 
    242.2842 M+ (C4H9)4N+ Tetrabutyl ammonium
    255.2329  M-H-  C16H31O2-  Palmitic acid anion 
    279.1590  M+H+  C16H22O4H+  Di-butylphthalate, plasticizer 
    282.2791  M+H+  C18H35NOH+  Oleamide, Oleic acid amide, Gleitmittel für Plastik (Spritzen!) 
    283.2642  M-H-  C18H35O2-  Stearic acid anion 
    301.0752  M+Na+  C18H15PONa+  Triphenylphosphinoxid 
    301.1410  M+Na+  C16H22O4Na+  Di-butylphthalate, plasticizer 
    304.2610  M+Na+  C18H35NONa+  Oleamide, Oleic acid amide, Gleitmittel für Plastik (Spritzen!) 
    360.3237 M+Na+ C22H43NONa+ Erucamide
    365.1054  M+Na+  C12H22O11Na+  Disaccharide 
    381.2971
         		 M+Na+  C21H42O4Na+  Glycerinmonostearate
     
    391.2842  M+H+  C24H38O4H+  Di-iso-octylphthalate, Weichmacher 
    393.2975 M+Na+ C22H42O4Na+ Bis(2-ethylhexyl) adipat, DOA
    413.2662  M+Na+  C24H38O4Na+  Di-iso-octylphthalate, Weichmacher 
    517.2958
    519.2955    		 M+Ag+ C30H50Ag+ Squalene + Ag+
    605.3155  M+H+  C33H50P2O6H+  Ultranox 626 antioxidant, Bis (2,4-di-t-butylphenyl)Pentaerythritol Diphosphite 
    627.2974  M+Na+  C33H50P2O6Na+  Ultranox 626 antioxidant, Bis (2,4-di-t-butylphenyl)Pentaerythritol Diphosphite 
    637.3053  M+H+  C33H50P2O8H+  XR 2502 = oxidzed form of Ultranox 626, Bis (2,4-di-t-butylphenyl)Pentaerythritol Diphosphate 
    647.4587  M+H+  C42H63O3PH+  Irganox 168 (PE and PP stabilizer) Tri(2,4di-tert-butylphenyl)phoshate 
    659.2873  M+Na+  C33H50P2O8Na+  XR 2502 = oxidzed form of Ultranox 626, Bis (2,4-di-t-butylphenyl)Pentaerythritol Diphosphate 
    663.4536  M+H+  C42H63O4PH+  Oxidized form of irganox 168 (PE and PP Stabilisator) Tri(2,4di-tert-butylphenyl)phoshate 
    669.4407  M+Na+  C42H63O3PNa+  Irganox 168 (PE and PP stabilizer) Tri(2,4di-tert-butylphenyl)phoshate 
    685.4356  M+Na+  C42H63O4PNa+  Oxidized form of irganox 168 (PE and PP Stabilisator) Tri(2,4di-tert-butylphenyl)phoshat

    M+H+ = protoniertes Molekül
    M+ = Permanentkation
    M-H- = deprotoniertes Molekül

  • Spektren zitieren

    Wie zitiere ich Massenspektren in einer Bachelor, Master- oder Doktorarbeit?


    Üblicherweise teilt sich ein Zitat in zwei Teile, einen allgemeinen, in der die verwendeten Geräte und Methoden genannt werden (ggfs. können hier auch gemeinsame Messbedingungen z.B. GC-Konditionen mitgenannt werden) und einen speziellen für die einzelne Messung.


    Die im Bereich der OC eingesetzten Geräte wären im allgemeinen Teil folgendermaßen zitierbar:

    In jedem Fall ist der entsprechende Aufdruck auf den Spektrenausgaben zu beachten, hier findet sich Gerätebezeichnung sowie Ionisierungsmethode!

    • Massenspektren mit Direkteinlass und Elektronenionisation (EI) wurden mit dem Triplequad TSQ 7000 (Thermo-Finnigan-MAT, Bremen) gemessen.
    • Massenspektren mit GC-Einlass und Elektronenionisation (EI) wurden mit dem Triplequad Quattro Micro GC (Waters-Micromass, Manchester,UK) gemessen. Als GC-Säule wird seit 01/2016 folgende Trennsäule eingesetzt: Optima 5MS (30m, ID 0,25mm, 0,25µm Filmdicke, entspricht von den Trenneigenschaften einer HP5) Messungen davor wurden ebenfalls auf HP5-äquivalenten Säulen durchgeführt.
    • Massenspektren mit GC-Einlass und Elektronenionisation (EI) wurden auf dem Gerät GC17A mit QP5050 Single Quad Massenspektrometer (Shimadzu Deutschland GmbH) vorgenommen. (Gerät nicht mehr in Benutzung.)
    • Massenspektren mit GC-Einlass und Elektronenionisation (EI) wurden auf dem Gerät Trace 1310 mit ISQ 7000 Single Quad Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) vorgenommen. Als GC-Säule wird seit 11/2018 folgende Trennsäule eingesetzt: Thermo Gold TG-5HT (30m, ID 0,25mm, 0,1µm Filmdicke, entspricht von den Trenneigenschaften einer HP5)
    • Massenspektren (akkurate Massen) mit GC-Einlass bzw. Schubstange und Elektronenionisation (EI) wurden auf dem Gerät Trace 1310 mit GC Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) vorgenommen. Als GC-Säule wird seit 11/2018 folgende Trennsäule eingesetzt: Thermo Gold TG-5SILMS (30m, ID 0,25mm, 0,25µm Filmdicke, entspricht von den Trenneigenschaften einer HP5)
    • Massenspektren mit HPLC-Einlass und Elektrosprayionisation (ESI) wurden auf dem Gerät 6110 (Agilent, Santa Clara CA, USA) vorgenommen.
    • MALDI Massenspektren wurden mit dem Autoflex Speed (Bruker Daltonics, Bremen) aufgenommen. Es wurde ein SmartBeamTM NdYAG-Laser mit 355nm Wellenlänge verwendet.
    • MALDI Massenspektren (sofern in der AC gemessen) wurden mit dem REFLEX IV (Bruker Daltonics, Bremen) aufgenommen. Es wurde ein N2-Laser mit 337nm Wellenlänge und 3ns Pulsdauer verwendet.
    • ESI-Massenspektren wurden auf dem QUATTRO LCZ (Waters-Micromass, Manchester, UK) mit Nanosprayeinlass gemessen. (Gerät nicht mehr in Benutzung.)
    • ESI-Massenspektren wurden auf dem QUATTRO LCZ (Waters-Micromass, Manchester, UK) mit der TLC-MS Kopplung (Eigenbau, OC Münster) gemessen. (Gerät nicht mehr in Benutzung.)
    • ESI-Exakte Massenbestimmung wurde auf dem MicroTof (Bruker Daltronics, Bremen) mit Schleifeneinlass vorgenommen. Die Massenkalibrierung erfolgte unmittelbar vor der Probenmessung an Natriumformiat-Clustern durch eine quasiinterne Kalibrierung.
    • ESI-Messungen wurde auf der LTQ Orbitap LTQ XL (Thermo-Fisher Scientific, Bremen) mit Schleifeneinlass (alternativ HPLC, Spritzenpumpe, Nanospray) vorgenommen.
    • APCI-Messungen wurde auf der LTQ Orbitap LTQ XL (Thermo-Fisher Scientific, Bremen) mit Schleifeneinlass vorgenommen.

     

    Im speziellen Teil, der sich mit den einzelnen Verbindungen befasst, kann man so zitieren:

     

    MS (EI-Direkteinlass):

    m/z (%) = 306 (2) [M-.OCH3]+ , 294 (6) [M-HNCO].+ , 150 (12), 55 (87) [C4H7]+

    In diesem Beispiel kann man die verschiedenen Stufen der Erläuterungen erkennen:

    Minimalzitat nur m/z und Intensität 150 (12)
    etwas genauer m/z, Intensität und Summenformel 55 (87) [C4H7]+
    noch genauer m/z, Intensität und Struktur/Fragmentierung 306 (2) [M -.OCH3]+

     

    Der Radikalcharakter von Abspaltungen oder Ionen sollte angegeben werden.
    In der Regel werden nicht alle Ionen zitiert, als Faustregel kann gelten: alle Intensitäten >20%,  dazu alle zur Charakterisierung wichtigen Ionen, speziell aus dem oberen m/z Bereich.

    MS-ESI (+):
    m/z (%) = 360 (100)  [M+Na]+ , 338 (25)  [M+H]+ .

    Bei komplexen Isotopenclustern kann man folgendermassen formulieren:

    MS-ESI (+)
    Isotopencluster um m/z 402,5, die Intensitätsverteilung entspricht der Berechnung für [C20H20PdCl]+ .

    Hier würde man den Schwerpunkt des Clusters, also die stöchiometrische Masse des Ions angeben. Ist es zur Strukturcharakterisierung besonders bedeutsam, kann man natürlich auch die Intensitäten der einzelnen Linien nach dem Muster gefunden/berechnet oder aber eine Abbildung des gemessenen Isotopenmusters verglichen mit dem berechneten angeben.
     

    Kann eine Trennung der Isotopenlinien nicht erreicht werden (z.B. bei MALDI im hohen Massenbereich,) so wird der stöchiometrische m/z-Wert (=Schwerpunkt des Isotopenclusters) zitiert.

    MS-MALDI (+) Linear- oder Reflektor-Modus
    - nicht isotopenaufgelöste Spektren (meist im Linear-Modus):
        m/z (Schwerpunkt der Peakgruppe) (%) = 2328,02 (100) [C120H198N20O24 +Na]+
    - isotopenaufgelöste Spektren (meist im Reflektor-Modus):
        wie bei MS-ES(+), es wird in der Regel die monoisotpische Masse angegeben

    Messungen von Exakten Massen sind natürlich mit einem Fehler behaftet. Akzeptiert wird im Allgemeinen ±0,005 u bzw. 5 ppm.

    MS-EI-EM
    m/z  = 260,1543 [M+.], berechnet für C20H20 260,1565.

    MS-ESI-EM
    m/z  = 382,1405 [M+H+], berechnet für C20H20N3O5 = 382,1397.

    Bitte berücksichtigen, dass für die Berechnung der exakten Massen (vor allem bei ESI) auch die Elektronenmasse relevant ist. Diese ist entsprechend zu berücksichtigen!

    Die Begriffe “Hochauflösung” und “HR” sollten nicht verwendet werden, denn es handelt sich tatsächlich um eine "Exakte Massenbestimmung" (meist nur bei mittlerer Auflösung).

     

     

    Im Zweifelsfall sollte man immer in der MS-Abteilung nachfragen, und nicht aus Arbeiten von “anno tobak” Geräte zitieren, die gar nicht mehr existierten!