Abgeschlossenes Projekt


Biotechnologische Produktion von Vanillin

 

Vanillin ist der charakteristische Aromabestandteil der Vanilleschote. Bei der Lebensmittel- und Parfümherstellung ist Vanillin einer der am häufigsten eingesetzten Aromastoffe. Chemisch wird "künstliches" bzw. "naturidentisches" Vanillin synthetisiert. Dabei dienen Guaiacol aus der Petrochemischen-Industrie bzw. Lignin als Rohstoff.

Bedingt durch die gestiegene Nachfrage der Verbraucher nach "natürlichen" bzw. "gesunden" Nahrungsmitteln, konnte der Bedarf an natürlichem Vanillin nicht mehr mit der aus Vanilleschoten gewonnenen Aromamischung gedeckt werden. Daher kam dem durch Biotransformation aus natürlichen Rohstoffen gewonnenen "natürlichen" Vanillin eine steigende Bedeutung zu.



Im Arbeitskreis Steinbüchel wurden zwei Biotransformationsprozesse untersucht, die auf der mikrobiellen Umsetzung der natürlich vorkommenden Aromaten Eugenol bzw. Ferulasäure basieren.

Im ersten Prozess wurde Eugenol, welches den Hauptbestandteil des aus Gewürznelkenblättern (Syzygium aromaticum) gewonnenen ätherischen Öls darstellt, mit Hilfe eines Bakteriums der Gattung Pseudomonas umgesetzt. Obwohl Eugenol antibakterielle Eigenschaften aufweist, auf Grund derer es in der Zahnheilkunde häufig eingesetzt wird, ist das genannte Bakterium in der Lage Eugenol vollständig abzubauen. Der Katabolismus verläuft über Coniferylalkohol, Coniferylaldehyd, Ferulasäure, Vanillin, Vanillinsäure und Protocatechusäure; letztere wird nach "Ortho-Spaltung" über den bekannten 3-Oxoadipat-Weg in den Intermediärstoffwechsel eingeschleust.

Im Rahmen eines Screenings nach neuen Mikroorganismen, die in der Lage sind Ferulasäure zu Vanillin umzusetzen, wurde ein Gram-positives Bakterium der Gattung Amycolatopsis isoliert. Der Katabolismus von Ferulasäure in diesem Bakterium erfolgt in ähnlicher Weise wie in dem Gram-negativen Pseudomonas Stamm.


Die physiologischen und genetischen Grundlagen beider Vanillin-Produktionsprozesse wurden seinerzeit intensiv untersucht. Die für die Abbauleistungen verantwortlichen Enzyme wurden identifiziert, und die entsprechenden, codierenden Gene wurden identifiziert, kloniert und sequenziert. Die essentiellen Funktionen dieser Gene wurden durch Expression in E. coli und durch Inaktivierung mittels gezielter Mutagenese überprüft.

Ziele des Projektes waren:

  • Detaillierte Untersuchung der Abbauwege für Eugenol und Ferulasäure
  • Identifizierung von Genen, die für diese Abbauwege essentiell sind
  • Identifizierung und biochemische Charakterisierung involvierter Enzyme
  • Optimierung der Produktionsstämme durch "Genetic Engineering"

Methoden und Strategien

  • Isolierung neuer Mikroorganismen die in der Lage waren Eugenol und/oder Ferulasäure zu verstoffwechseln
  • Isolierung von Mutanten, die Defekte in den entsprechenden Abbauwegen aufwiesen
  • Identifizierung von essentiellen Genen durch Komplementationsanalysen
  • Klonierung und Expression entsprechender Gene in unterschiedlichen Bakterien
  • Ausschalten bzw. Veränderung der Eigenschaften von Enzymen durch gerichtete Mutagenesen
  • Aufreinigung und biochemische Charakterisierung von relevanten Enzymen
  • Analyse der Sequenzinformationen der diversen Genom-Sequenzierungsprojekte bezüglich relevanter Gene, die für Biotransformationsreaktionen von Interesse sind.

Stichwörter:

Biotransformation, Eugenol, Coniferylalkohol, Coniferylaldehyd, Ferulasäure, Feruloyl-CoA, Vanillin, Vanillinsäure, Protocatechusäure, Pseudomonas, Amycolatopsis, Delftia, Bacillus, Eugenol-Hydroxylase, Flavocytochrome c, Coniferylalkohol-Dehydrogenase, Coniferylaldehyd-Dehydrogenase, Feruloyl-CoA Synthetase, Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase, Vanillin-Dehydrogenase

Am Projekt beteiligte Mitarbeiter waren
 Koorperationspartner, Förderung, Finanzierung




 Stefanie Kellner
Horst Priefert
Alexander Steinbüchel
Jörg Overhage
Rainer Plaggenborg
Sandra Achterholt
Kerstin Brandt
Andreas U. Kresse
Daniela Rehder		 Symrise GmbH & Co. KG (Holzminden) (Zusammenschluss des früheren Kooperationspartners Haarmann & Reimer GmbH mit der Fa. Dragoco)
Europäische Gemeinschaft

Publikationen

I Publications in peer reviewed journals (original contributions)

  1. Plaggenborg, R., J. Overhage, A. Loos, J. A. C. Archer, P. Lessard, A. J. Sinskey, A. Steinbüchel, and H. Priefert. 2006. Potential of Rhodococcus strains for biotechnological vanillin production from ferulic acid and eugenol. Appl. Microbiol. Biotechnol., accepted for publication.
  2. Overhage, J., A. Steinbüchel, and H. Priefert. 2003. Highly efficient biotransformation of eugenol to ferulic acid and further conversion to vanillin in recombinant strains of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 69:6569-6576.
  3. Plaggenborg, R., J. Overhage, A. Steinbüchel, and H. Priefert. 2003. Functional analyses of genes involved in the metabolism of ferulic acid in Pseudomonas putida KT2440. Appl. Microbiol. Biotechnol. 61:528-535.
  4. Overhage, J., A. Steinbüchel, and H. Priefert. 2002. Biotransformation of eugenol to ferulic acid by a recombinant strain of Ralstonia eutropha H16. Appl. Environ. Microbiol. 68:4315-4321.
  5. Priefert, H., S. Achterholt, and A. Steinbüchel. 2002. Transformation of the Pseudonocardiaceae Amycolatopsis sp. HR167 is highly dependent on the physiological state of the cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58:454-460.
  6. Plaggenborg, R., A. Steinbüchel, and H. Priefert. 2001. Isolation and molecular characterization of genes essential for growth of Delftia acidovorans with ferulic acid. FEMS Microbiol. Lett. 205:9-16.
  7. Brandt, K., S. Thewes, J. Overhage, H. Priefert, and A. Steinbüchel. 2001. Characterization of the eugenol hydroxylase genes (ehyA/ehyB) from the new eugenol degrading Pseudomonas sp. strain OPS1. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56:724-730.
  8. Achterholt, S., H. Priefert, and A. Steinbüchel. 2000. Identification of Amycolatopsis sp. strain HR167 genes involved in the bioconversion of ferulic acid to vanillin. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54:799-807.
  9. Priefert, H., J. Overhage, and A. Steinbüchel. 1999. Identification and molecular characterization of the eugenol hydroxylase genes (ehyA/ehyB) of Pseudomonas sp. strain HR199. Arch. Microbiol. 172:354-363.
  10. Overhage, J., H. Priefert, and A. Steinbüchel. 1999. Biochemical and genetic analysis of the ferulic acid catabolism in Pseudomonas sp. strain HR199. Appl. Environ. Microbiol. 65:4837-4847.
  11. Overhage, J., H. Priefert, J. Rabenhorst, and A. Steinbüchel. 1999. Biotransformation of eugenol to vanillin by a mutant of Pseudomonas sp. strain HR199 constructed by disruption of the vanillin dehydrogenase (vdh) gene. Appl. Microbiol. Biotechnol. 52:820-828.
  12. Overhage, J., A. U. Kresse, H. Priefert, H. Sommer, G. Krammer, J. Rabenhorst, and A. Steinbüchel. 1999. Molecular characterization of the genes pcaG and pcaH, encoding protocatechuate 3,4-dioxygenase, which are essential for the vanillin catabolism in Pseudomonas sp. strain HR199. Appl. Environ. Microbiol. 65:951-960.
  13. Achterholt, S., H. Priefert, and A. Steinbüchel. 1998. Purification and characterization of the coniferyl aldehyde dehydrogenase from Pseudomonas sp. strain HR199 and molecular characterization of the gene. J. Bacteriol. 180:4387-4391.
  14. Priefert, H., J. Rabenhorst, and A. Steinbüchel. 1997. Molecular characterization of genes of Pseudomonas sp. strain HR199 involved in the bioconversion of vanillin to protocatechuate. J. Bacteriol. 179:2595-2607.

II Review arcticles in peer reviewed journals or books

  1. Priefert, H., J. Rabenhorst, and A. Steinbüchel. 2001. Biotechnological production of vanillin. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56:296-314.