Addiction Systeme

Abb.1: Prinzip eines Plasmidabhängigkeitssystems

Biotechnologische Prozesse verwenden häufig plasmidbasierte Expressionssysteme zur Produktion wichtiger Alltagsprodukte. Beispielhaft sei hier die industrielle Produktion von Insulin, Lipasen, Proteasen, Vitaminen oder zahlreicher Antibiotika im Fermentationsmaßstab von mehreren hunderttausend Litern genannt.

Der Verlust episomal codierter genetischer Fremdinformation auf sogenannten Plasmiden, vor allem im Teilungsstadium der Zellen, würde eine reduzierte Produktausbeute mit sich bringen. Der Einsatz von Antibiotika in diesen Prozessen verbietet sich oftmals durch den hohen Preis; als auch durch behördliche Auflagen (GMP/ FDA). Auch der Einsatz chromosomaler Integrationen im Wirtsgenom würde z. B. eine reduzierte Kopienzahl; der zu exprimierenden Fremd-DNA als auch den nicht zu vernachlässigenden Einfluss polarer Effekte mit sich bringen.

Die Natur hat zur Stabilisierung natürlich auftretender Plasmide zahlreiche Abhängigkeitsysteme entwickelt, deren Regulationsmechanismen bis dato noch nicht vollständig verstanden worden sind. Diese natürlichen Systeme basieren zum größten Teil auf einem Toxin/Antitoxin basierenden Prinzip, bei dem ein gebildetes Zelltoxin durch die plasmidcodierte Expression eines Antitoxins inhibiert oder neutralisiert wird. Ein Verlust des Plasmids führt daher zum Absterben der Zellen ohne Plasmid. Leider erreichen viele dieser Systeme aus den verschiedensten Gründen keine vollständige Plasmidstabilisierung und Kompatibilität mit etablierten Kultivierungsmethoden. Durch die steigende Anzahl neuer Genomsequenzen und die Aufklärung neuer Stoffwechselwege versuchen wir dieses Problem bei der Entwicklung maßgeschneiderter Abhängigkeitssysteme zu umgehen.

Ziele:

•    Etablierung neuer industriell anwendbarer Abhängigkeitssysteme zur stabilen Expression von Fremd-DNA in verschiedenen pro- und eukaryotischen Wirtsorganismen. Durch die Anwendung von Plasmid-Abhängigkeitssystemen kann auf den Einsatz teurer Antibiotika vor allem in großen Fermentationen und Langzeitkultivierungen vollständig verzichtet werden.

•    Zudem werden diese Systeme entwickelt um eine möglichst hohe Produktausbeute durch die Unterdrückung von häufig auftretenden Plasmidverlusten zu erreichen.

•    Durch die gezielte Entwicklung und Etablierung artifizieller Abhängigkeitssysteme konnte in der Klasse der metabolen Abhängigkeitssysteme erstmals ein Medien- und Kohlenstoffquellen unabhängiges System mit vollständiger Plasmidstabilisierung entwickelt und patentiert werden.

Dieses anwendungsorientierte Forschungsgebiet ist mit dem Einsatz eines breiten Methodenspektrums von in silico Arbeiten, über verschiedenste molekularbiologische Methoden bis hin zu Fermentationen im Pilotmaßstab verknüpft. Ein Beleg für die anwendungsbezogene Forschung ist nicht zuletzt ein gestiegenes Interesse seitens der Industrie an dem Einsatz derartiger Systeme im großen Maßstab.

Hauptmethoden:

•    Molekularbiologische Standardmethoden wie Klonierungen, ortsgerichtete Mutagenesen oder heterologe Expression
•    Design und Expression synthetischer DNA-Cluster
•    Metabolic Engineering
•    Fermentationen

Anwendungsgebiete:

•    Erhöhung der Produktausbeute biotechnologisch interessanter Syntheseprodukte (Insulin, Cyanophycin, PHB, Bio-/Mikrodiesel, etc.) sowie eine Antibiotika-freie Kultivierung durch die Unterdrückung von Plasmidverlusten
•    Kontrollierter Abbau von Schadstoffen oder Xenobiotika in einem begrenzten Einsatzgebiet
•    Anwendung als sogenanntes „containment system“ mit Wirkung als Suizidsystem nach einer ungewollten Freisetzung gentechnisch veränderter Microorganismen

Am Projekt beteiligte Mitarbeiter:

Dipl.-Biol. Jens Kroll
Dipl.-Biol. Nicole Lange
Christian Fleige, BSc.

Referenzen:

•    Kroll J., Klinter, S., and Steinbüchel A. (2010b) A novel plasmid addiction system for large-scale production of cyanophycin in Escherichia coli using mineral salts medium. Appl Microbiol Biotechnol 

•    Kroll,J.; Klinter, S.;Schneider, C; Voß, I. and Steinbüchel, A. Plasmid addiction systems: perspectives and applications in biotechnology Microbial Biotechnology (2010)

•    Kroll J., Steinle A., Reichelt R., Ewering E., and Steinbüchel A. (2009) Establishment of a novel anabolism-based addiction system with an artificially introduced mevalonate pathway: Complete stabilization of plasmids as universal application in white biotechnology. Metab Eng11: 168-177

•    Neuartiges, universell einsetzbares addiction-System. Patent application WO 2010/020494 A1

•    Voß I., and Steinbüchel A. (2006) Application of a KDPG-aldolase gene-dependent addiction system for enhanced production of cyanophycin in Ralstonia eutropha strain H16. Metab Eng 8: 66-78.