Mikrobielle Polyester

Schlüsselenzyme: PHA Synthase

Abb. 1
Polyhydroxyalkanoat (PHA)-Synthasen stellen die Schlüsselenzyme der Polyhydroxyalkanoat-Synthese dar und katalysieren die kovalente Verknüpfung der aktivierten Vorstufen. Mittlerweile wurden 59 PHA-Synthasegene aus 45 Bakterienspezies isoliert, deren Genprodukte eine hohe Homologie untereinander aufweisen. PHA-Synthasen werden zunächst als lösliche Proteine in der Zelle gebildet und erhalten mit beginnender PHA-Synthese amphiphilen Charakter. PHA-Synthasen mit kovalent verknüpfter PHA-Kette lagern sich zu Grana, den wasserunlöslichen Einschlüssen in der Zelle, zusammen. Die PHA-Synthasen befinden sich an der Oberfläche des Granulums. Als Substrate (aktivierte Vorstufe) der PHA-Synthase dienen (R)-3-Hydroxyacyl-Coenzyme A Thioester mit Kettenlängen von 3-14 Kohlenstoffatomen. Bisher wurden ca. 150 verschiedene Bausteine in Polyhydroxyalkanoaten nachgewiesen, was auf eine breite Substratspezifität der PHA-Synthasen hindeutet. Die PHA-Synthasen werden bezüglich der Substratspezifität und Zusammensetzung aus verschiedenen Untereinheiten in vier Klassen unterteilt (Tab. 1).

Das Substrat (R)-3-Hydroxylacyl-Coenzyme A wird zum Polyester bei gleichzeitiger Freisetzung von Coenzym A, polymerisiert. Dabei erfolgt eine kovalente Acylierung des konservierten Cysteinrestes der PHA-Synthase. Als möglicher Reaktionsmechanismus wird der Reaktionsmechanismus der Lipasen postuliert. Neben dem an der kovalenten Katalyse beteiligten, konservierten Cysteinrest wurden ebenso analog zu den Lipasen zwei weitere konservierte Reste, Aspartat und Histidin, gefunden, die essentiell für die PHA-Synthaseaktivität sind. Diese sogenannte katalytische Triade befindet sich in der "Core"-Struktur des Lipase-basierten topologischen Protein-Modells der PHA-Synthasen. Im Arbeitskreis werden Untersuchungen zur Identifizierung neuer PHA-Synthasen und zum Verständnis der Enzymologie durchgeführt.

Tab. 1 PHA-Synthasen werden in vier Klassen unterteilt.

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Anabolismus von PHAs

Aktivierte Vorstufen für die PHA-Biosynthese können grundsätzlich von dem zentralen Metaboliten Acetyl-CoA oder von Intermediaten der primären Stoffwechselwege Citrat-Zyklus, Fettsäure-ß-Oxidation und Fettsäure-de novo-Biosynthese sowie dem Stoffwechsel von Aminosäuren abgeleitet werden.

 

Abb. 2 Bereitstellung der PHA-Monomere in Ralstonia eutropha, Rhodospirillum rubrum, Aeromonas punctata und verschiedenen Pseudomonaden.

Ausgehend vom Acetyl-CoA wird mit Hilfe der PHA-Biosyntheseenzyme ß-Ketothiolase und Acetoacetyl-CoA-Reduktase (R)-3-Hydroxybutyryl-CoA gebildet, welches die direkte Vorstufe der Poly(3-Hydroxybuttersäure) darstellt. Dienen Fettsäuren als Kohlenstoffquelle so werden über die Fettsäure-ß-Oxidation in geringem Umfang Intermediate ((R)-3-Hydroxyacyl-CoA) bereitgestellt, die direkt als aktivierte Vorstufen für die PHA-Biosynthese dienen. In Pseudomonaden und Aeromonas caviae wurden PHA-biosynthetische (R)-spezifische Enoyl-CoA Hydratasen (PhaJ) identifiziert, die die enantioseleektive Umwandlung des (S)-3-Hydroxyacyl-CoA (Intermediat der Fettsäure-ß-Oxidation) in das (R)-Enantiomer katalysieren, welches direkt als aktivierte Vorstufe der PHA-Biosynthese dient. Pseudomonaden sind ebenso in der Lage ausgehend von einfachen Kohlenstoffquellen, wie z.B. Gluconat, PHAs zu synthetisieren, deren Bausteine Kettenlängen von 6-14 Kohlenstoffatomen umfassen. Hier werden Intermediate (Acyl Carrier Protein Thioester) der Fettsäure-de novo-Biosynthese durch das PHA-biosynthetische Enzym PhaG (Transacylase) in die korrespondierenden Coenzym A Thioester überführt. PhaG wurde bisher nur in Pseudomonaden gefunden und katalysiert die metabole Verknüpfung zwischen Fettsäure-de novo-Biosynthese und PHA-Synthese. Im Arbeitskreis wurde erstmals die rekombinante Biosynthese von PHAs, bestehend aus nur 4-Hydroxybuttersäure oder Bausteinen mit einer Kettenlänge von C6-C14, in Escherichia coli etabliert.

Forschungsschwerpunkt ist die Etablierung neuer PHA-Biosynthesewege in rekombinanten Produktionsstämmen durch 'metabolic engineering'. Hierzu ist es ebenso erforderlich, dass neue Gene identifiziert werden, deren Genprodukte eine nützliche Funktion für die Etablierung neuer Stoffwechselwege haben könnten. Dadurch sollten möglichst viele PHAs aus einfachen und preiswerten Kohlenstoffquellen und nicht wie bisher überwiegend aus teuren und z.T. toxischen Vorstufensubstraten synthetisiert werden können.
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In vitro Biosynthese von PHAs

Abb. 3

Die zellfreie in vitro Biosynthese von PHAs erlaubt die Synthese von definierten PHAs und ermöglicht die biochemische enzymologische Untersuchung von an der PHA-Biosynthese beteiligten Enzymen. Untersuchungen zur in vitro PHA-Biosynthese ermöglichen grundsätzlich die Etablierung der entsprechenden PHA-Biosynthesewege in vivo. Da die in vitro PHA-Biosynthese entweder aktivierte Vorstufen (Coenzym A Thioester) oder für die Aktivierung energiereich Phosphatester benötigt, ist die zellfreie Biosynthese von PHAs ein sehr teures Verfahren. Durch das Recyclisieren von Cofaktoren sind die Synthesekosten bereits deutlich gesunken.
Im Arbeitskreis wurden verschiedene in vitro Biosyntheseverfahren entwickelt, die von der einstufigen Synthese bis zur dreistufigen Synthese reichen und die es ermöglichen, unterschiedliche definierte und hochmolekulare PHAs zu synthetisieren. Forschungsschwerpunkt der Arbeitsgruppe ist es, in vitro Biosyntheseverfahren zu entwickeln, die zur Synthese neuer Polyester mit neuartigen Materialeigenschaften führen. Zudem soll die in vitro Biosynthese genutzt werden, um die an der Synthese beteiligten Enzyme molekular zu charakterisieren.
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Biotechnologische Produktion von PHAs

Abb. 4 PHB-Granulat, welches für die Weiterverarbeitung (z.B. für Verpackungen) zur Verfügung steht (oben). Fermenter im 30 l Maßstab der Fa. Braun, Melsungen (unten)

Erkenntnisse, die über den Stoffwechsel von PHAs sowie über die Biochemie der PHA Synthasen gewonnen wurden, und auch gentechnisch veränderte Bakterien werden zur Etablierung neuer oder verbesserter Verfahren zur biotechnologischen Produktion von PHAs herangezogen. Diese Untersuchungen sollen die Nutzung nachwachsender Rohstoffe (Saccharose, Lipide, Lävulinsäure), Abfall- und Reststoffe der Landwirtschaft (Melasse, Molke) und chemischen Industrie (Restöl aus Rhamnoseproduktion) sowie fossiler Rohstoffe (Braunkohle) zur kostengünstigen fermentativen Produktion von PHAs erschließen.
Außerdem sollen neue PHAs und PHAs mit besonderen Bausteinen in ausreichenden Mengen bereitgestellt werden, damit die physikalischen Eigenschaften und Materialeigenschaften sowie die Verarbeitung dieser PHAs erforscht werden können. Außerdem sollen hierdurch Untersuchungen zum biologischen Abbau dieser PHAs ermöglicht werden.
Hierzu steht dem Arbeitskreis ein neues Biotechnikum mit Bioreaktoren für die Anzucht von heterotrophen Bakterien im Maßstab von bis zu 500 L sowie einen Photobioreaktor zur Kultivierung phototropher Mikroorganismen im 80 L Maßstab zur Verfügung. Außerdem können extrem halophile Archaebakterien in einem korrosionsgeschützten Bioreaktor im 10 L Maßstab kultiviert werden.
In Kooperation mit Pflanzenzüchtern wird außerdem angestrebt, transgene Pflanzen zur Produktion von PHAs zu erzeugen. Der Beitrag des Arbeitskreises besteht dabei in der Bereitstellung von Genen, die für die Biosynthese von PHAs wichtig sind, und in der Analyse von Proteinen.
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Struktur und Aufbau von PHA Grana

PHAs werden in der Bakterienzelle in Form cytoplasmatischer Einschlüsse als Speicherstoff abgelagert. Diese PHA-Grane sind von einer aus Proteinen und Phospholipiden bestehenden Hüllmembran umgeben. Neben der PHA Synthase und wahrscheinlich auch der PHA Depolymerase, die beide nur einen relativ geringen Anteil der Hüllproteine ausmachen, kommt in allen PHA akkumulierenden Bakterien mindestens ein weiteres, von der Menge her dominierendes Protein vor.
Poly(3HB) akkumulierende Bakterien wie Ralstonia eutropha besitzen meist nur ein weiteres Hüllprotein. Es handelt sich dabei um ein amphiphiles Protein mit meist niedrigem Molekulargewicht, welches außerordentlich fest an die Granaoberfläche gebunden ist. Diese in Analogie an die die Triglycerid-Einschlüsse in Pflanzenzellen umgebenden Oleosine als Phasine bezeichneten Proteine wurden erstmals in Poly(3HB)-leaky Mutanten von R. eutropha entdeckt. Fehlt das 24-KDa Phasinprotein, akkumulieren die Zellen weniger Poly(3HB), und in den Zellen kommt im Gegensatz zum Wildtyp nur noch ein einziges, sehr großes PHA Granulum vor. Da die Oberfläche der PHA-Grana in diesen Mutanten weitgehend "nackt" vorliegt, verschmelzen die Grana mit den hydrophoben PHA Molekülen miteinander.

 

Abb. 5 Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Mutanten des Bakteriums R. eutropha: oben, Phasin negative Mutante, unten, Repressorprotein negative Mutante.

Neben dem Phasin aus R. eutropha wurde auch das Phasin aus Rhodococcus ruber untersucht. Detaillierte biochemische und molekulargenetische Untersuchungen wurden durchgeführt um die Funktion dieser neuen Proteinklasse, deren Binderegion an die Grana, und deren Einfluß auf die Synthese von PHAs aufzuklären. Die Expression des Phasingens (phaP) wird in R. eutropha durch das Repressorprotein PhaR reguliert, welches an die PHA-Grana sowie an die Promotorregionen von phaP und phaR binden kann. Durch die Herstellung von PhaR-Mutanten konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von PhaP zur Bildung einer erhöhten Anzahl von Grana führt.
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Regulation des PHA Stoffwechsels

Über die Regulation der PHA Biosynthese und dem intrazellulären Abbau ist relativ wenig bekannt. Wir untersuchen Ralstonia eutropha als Modellorganismus um Licht in diese wenig untersuchten Vorgänge zu bringen.
In R. eutropha werden die Enzyme für die Biosynthese konstitutiv exprimiert. Offensichtlich sind die intrazellulären Konzentrationen von Acetyl-CoA und freiem CoenzymA und die allosterische ß-Ketothiolase entscheidend dafür, ob die Synthese von Poly(3HB) einsetzt und die Zellen den Speicherstoff akkumulieren können. Im Gegensatz hierzu wird die Expression des Phasinproteins und wahrscheinlich auch der am intrazellulären Abbau beteiligten Enzyme auf der Ebene der Transkription und/oder Translation reguliert. Ein Regulatorprotein, welches in diesen Vorgang involviert ist, wurde identifiziert. Darüber hinaus wurden zwei Gene identifiziert, deren Translationsprodukte Homologien zu Komponenten des PEP: Phosphotransferase-Systems anderer Bakterien aufweisen (HPr und Enzym-I). Diese Gene (phaH und phaI) sind ebenfalls an der Regulation beteiligt. Die uns bekannten Regulatorproteine werden gegenwärtig biochemisch und molekulargenetisch untersucht (siehe auch "Struktur und Aufbau der PHA-Grana").
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Poly(malat)

Poly(malat), PMA, ist der einzige in der Natur vorkommende wasserlösliche Polyester. PMA wird ausschließlich von einigen eukaryontischen Lebewesen synthetisiert und scheint in Bakterien nicht vorzukommen.

Abb. 6 Poly(malat)
Mehrere Spezies aus der Gattung Aureobasidium wurden im Hinblick auf die Fähigkeit PMA zu synthetisieren und in das Medium ausscheiden zu können untersucht. Dabei wurden mehrere Stämme des Pullulan-produzierenden Pilzes Aureobasidium pullulans identifiziert, die PMA in großen Mengen synthetisieren.

In einem Stamm von A. pullulans wurde die Synthese von PMA detaillierter im Hinblick auf die anzuwendenden Kulturbedingungen, die Kohlenstoffquelle, den Einfluß von Inhibitoren und das polymerisierende Enzym untersucht. Es deutete sich an, dass PMA offensichtlich durch ein von den PHA Synthasen unterschiedliches Enzymsystem synthetisiert wird. Für A. pullulans wurde ein Plasmidvektor für die Übertragung von DNA entwickelt.
Darüber hinaus wurde PMA fermentativ in größeren Mengen produziert und isoliert. Außerdem wurden Bakterien isoliert, die PMA abbauen und als alleinige Kohlenstoffquelle zum Wachstum nutzen konnten.
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Stichwörter

Acetoacetyl-CoA Reduktase, Acrylsäure, Alcaligenes eutropha, Allochromatium vinosum, Arabidopsis thaliana, Aureobasidium pullulans, Bacillus megaterium, Biologisch abbaubare Polymere, Biopol, Burkholderia cepacia, Burkholderia sacchari, Chromatium vinosum,Chromobacterium violaceum, Clostridium acetobutylicum, Comamonas acidovorans, Copolyester, Cyanobakterien, Esterase, Fettsäurestoffwechsel, Granula, 3-Hydroxy-ACP-CoA Transferase, 3-Hydroxybuttersäure, 4-Hydroxybuttersäure, in vitro Synthese, ß-Ketothiolase, Lävulinsäure, 3-Mercaptopropionsäure, Metabolic engineering, Methylobacterium extorquens, Mycoplana rubra, Nachwachsende Rohstoffe, Nilrot, PEP - Phosphotransferasesystem, PHA, PHA-leaky Mutanten, PHA-negative Mutanten, PHA Depolymerase, PhaA, PhaB, PhaC, PhaG, PhaR, PhaP1, PhaP2, PhaP3, PhaP4, Phasine, PHA Synthase, PHB, PHF Synthase, Polyester, Polyhydroxyalkanoate, Polyhydroxyfettsäuren, Polymalat, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fragi, Pseudomonas mendocina,Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida, Pseudomonas saccharophila, PtsH, PtsI, Ralstonia eutropha, Rhodobacter sphaeroides, Rhodococcus ruber, Rhodospirillum rubrum, Speicherstoffe, Succinatsemialdehyd Dehydrogenase, Sudanschwarz, Synechococcus sp. strain MA19,Synechocystis sp. strain PCC6803, Thiocapsa pfennigii, Thiocystis violacea, Thioesterase,Umbellularia californica

Am Projekt beteiligte Mitarbeiter

Zur Zeit: Matthias Raberg
Jessica Eggers
Nicole Lindenkamp
Elena Volodina
Herbert Ahlers
Früher Amro Amara
Andreas Pries
Andreas Renkert
Arnulf Timm
Astrid Hoppensack
Axel Bethke
Beatriz S. Mendez
Bernd Füchtenbusch
Bernd H. A. Rehm
Bianca Uischner
Carmen Dudek
Carolin Gödde
Chlud Kaddor
Christian Brämer
Christina Föllner
Daniel Mergelkamp
Dieter Jendrossek
Dirk Baumeister
Dirk Fabritius
Felix Godoy
Folke Hosefelder
Francis Hezayen
Frank Eckert
Frank Reinecke
Gundula Zwingmann
Gustavo J. Vazquez
Hector M. Alvarez
Helena Müller
Henrike Knizia
Henry Valentin
Ingo Voß
Ingrid Knocke
Isabelle Twilfer
Jan Bechmann
Jonas Schlüter
Jürgen Paletta
K. Sonomoto
Karsten Rose
Katja Peplinski
Kenny Kuchta
Kerstin Brandt
Kerstin Brückener
Kristin Aerts
Liv Neumann
Markus Pötter
Martin Lahrkamp
Matthias Liebergesell
Mohammad H. A. Ibrahim
M. Filomena A. Rodrigues
Marc Wältermann
Niels Krüger
Nils Hoffmann
Patricia Spiekermann
Peter Schubert
Qingsheng Qi
R. Habibian
Rainer Kalscheuer
Ralf Jossek
Regina V. Antonio
Roman Wieczorek
Sandra Kohaus
Shuangjiang Liu
Shuishan Song
Silke Fiedler
Silke Hein
Silvia Heiss
Stefan Langenbach
Stefan Wiese
Stefanie Grote
Timo Stiefermann
Tina Lütke-Eversloh
Tran Hai
Ulrike Brandt
Ursula Pieper-Fürst
Uwe Oelmüller
Uwe Remminghorst
Volker Gorenflo

Koorperationspartner, Förderung, Finanzierung
In den letzten ca. 15 Jahren wurden die Untersuchungen häufig im Rahmen von Kooperationen mit Partnern aus dem In- und Ausland durchgeführt. Finanzielle Unterstützungen wurden dabei von zahlreichen öffentlichen Institutionen und Partnern aus der Industrie erhalten.

Kooperationspartner:

Institut für Physik der Westfälischen Wilhelms- Universität Münster, Germany (Prof. Dr. H. Eckert)
Institut für Physik der Westfälischen Wilhelms- Universität Münster, Germany (Prof. Dr. H. Fuchs)
Institut für Mikrobiologie und Genetik der Georg-August-Universität Göttingen, Germany (Prof. Dr. F. Mayer, Dr. M. Madkour, Prof. Dr. G. Gottschalk, Dr. B. Söhling)
Institut für Organische Chemie der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster, Germany (Dr. H. Luftmann, Dr. K. Bergander)
Institut für Biochemie und Chemosensorik der TU Hannover, Germany (Prof. Dr. T. Scheper)
Institut für Polymerforschung Dresden e.V., Germany (Dr. G. Schmack)
Umweltforschungszentrum Leipzig, Germany (Prof. Dr. W. Babel, Dr. C. Föllner)
Institut für Pflanzenzüchtung der Christian-Albrechts-Universität Kiel, Germany (Prof. Dr. C. Jung)
Botanisches Institut der Universität München, Germany (Prof. Dr. H.-U. Koop)
Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, Golm, Germany (Prof. Dr. L. Willmitzer)
Gesellschaft für Biotechnologische Forschung, Braunschweig, Germany (Prof. Dr. R. Jonas)
Institut für Biotechnologie - ETH Zürich, Switzerland (Prof. Dr. B. Witholt)
ATO, Wageningen, The Netherlands (Dr. G. Eggink, Dr. H. Mooibroek)
Institut de Biologie et Physiologie Végétales, University of Lausanne, Switzerland (Prof. Dr. Y. Poirier)
IPT, Sao Paolo, Brazil (Dr. L. Ferreria, Dr. F. Rodrigues)
Departamento. de Quimica Biologia, University of Buenos Aires, Argentina (Prof. Dr. B. Mendez)
Instituto de Biociencias, Universidade Federal Do Rio Grande Do Sul, Brazil (Prof. Dr. A. Henriques)
KAIST, Taejon, Korea (Prof. Dr. S.-Y. Lee)
Department of Chemistry, Pulp and Paper Research Center, McGill University, Montreal, Canada (Prof. Dr. R. Marchessault)
Depto de Bioquímica, Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco, Comodora Rivadavia, Argentina (Prof. Dr. H. Alvarez)
Department of Botany and Microbiology, Alexandria University, Egypt (Prof. Dr. S. Omar)
Fa.Planta (Einbeck, Germany)

Finanzielle Unterstützung:

Deutsche Forschungsgemeinschaft (Bonn, Germany)
Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie - BMBF (Bonn, Germany)
Bundesministerium für Verbraucherschutz, Ernährung und Landwirtschaft - BMVEL (Bonn, Germany)
GenoMik Netzwerk (Göttingen, Germany)
Deutscher Akademischer Austauschdienst - DAAD (Bonn, Germany)
Deutsche Forschungsanstalt für Luft- und Raumfahrt - DLR
Alexander von Humboldt Stiftung (Bonn, Germany)
Max-Buchner Forschungsstiftung der DECHEMA (Frankfurt, Germany)
Fonds der Chemischen Industrie (Frankfurt, Germany)
Europäische Union - DG XII (Brüssel, Belgium)
Imperial Chemical Industries / Zeneca (London, UK)
Monsanto (St. Louis, USA)
Metabolix Inc. / Tepha Inc. (Cambridge, USA)

Publikationen

Schlüsselenzyme: PHA Synthase

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  2. Hai, T., D. Lange, R. Rabus, and A. Steinbüchel. 2004. Polyhydroxyalkanoate (PHA) accumulation in sulfate-reducing bacteria and identification of a class-III PHA synthase (PhaEC) in Desulfococcus multivorans. Appl. Environ. Microbiol. 70:4440-4448.
  3. Hezayen, F., B. H. , A. Steinbüchel, and B. H. A. Rehm. 2002. Biochemical and enzymological properties of the polyhydroxybutyrate synthase from the extremely halophilic archaeon strain 56. Arch. Biochem. Biophys. 403:284-291.
  4. Amara, A. A., A. Steinbüchel, and B. H. A. Rehm. 2002. In vivo evolution of the Aeromonas punctata polyhydroxyalkanoate (PHA) synthase: Isolation and characterization of modified PHA synthases with enhanced activity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59:477-482.
  5. Hein, S., J. Paletta, and A. Steinbüchel. 2002. Cloning, characterization and comparison of the Pseudomonas mendocina polyhydroxyalkanoate synthases PhaC1 and PhaC2. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58:229-236.
  6. Green, P. R., J. Kemper, L. Schechtman, L. Guo, M. Satkowski, S. Fiedler, A. Steinbüchel, and B. H. A. Rehm. 2002. Formation of short chain length/medium chain length polyhydroxyalkanoate copolymers by fatty acid ß-oxidation inhibited Ralstonia eutropha. BioMacromolecules 3:208-213.
  7. Rehm, B. H. R., R. V. Antonio, P. Spiekermann, A. A. Amara, and A. Steinbüchel. 2001. Molecular characterization of the poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) synthase from Ralstonia eutropha: In vitro evolution, site-specific mutagenesis and development of PHB synthase protein model. Biochim. Biophys. Acta 1594:178-190.
  8. Pettinari, M. J., G. J. Vazquez, D. Silberschmidt, B. H. A. Rehm, A. Steinbüchel, and B. S. Mendez. 2001. Poly(3-hydroxybutyrate) synthesis genes in Azotobacter chroococcum strain FA8. Appl. Environ. Microbiol. 67:5331-5334.
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  16. Clemente, T., D. Shah, M. Tran, D. Stark, S. Padgette, D. Dennis, K. Brückener, A. Steinbüchel, and T. Mitsky. 2000. Sequence of PHA synthase gene from two strains ofRhodospirillum rubrum and In vivo substrate specificity of four PHA synthases across two heterologous expression systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 53:420-429.
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Anabolismus von PHAs

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Biotechnologische Produktion von PHAs

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