Influence of Musashi RNA-binding protein expression on triple negative breast cancer stem cells and radiosensitivity

Antragsteller: Fabian Troschel
Fachbereich, Studienrichtung: Medizinische Fakultät, Klinik für Strahlentherapie – Radioonkologie
Projekttitel: Influence of Musashi RNA-binding protein expression on triple negative breast cancer stem cells and radiosensitivity
Fördersumme: 4.832,00 Euro
Kontakt: Fabian Troschel

Projektbeschreibung:

Beim Mammakarzinom, der häufigsten malignen Karzinomerkrankung der Frau, fördern Brustkrebsstammzellen aggressiv-invasives sowie metastatisches Wachstum. Sie besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind wenig chemo- und/oder radiosensitiv. Die Prognoserelevanz dieser Subpopulation hat das therapeutische Targeting der Brustkrebsstammzellen zunehmend in den wissenschaftlichen Fokus gerückt.
Der notch-Signalweg ist ein wesentlicher biochemischer intrazellulärer Signalweg, der als ein prominenter Aktivator von Stammzelleigenschaften bekannt ist (z. B. Wang et al., 2012). Zuletzt wurden die Musashi RNA-bindenden Proteine mit der Aktivität des notch-Pathways in Verbindung gebracht (z. B. Lagadec et al., 2014). Der notch-Signalweg begünstigt Radioresistenz (Shen et al., 2015). Folglich stellte sich die Frage, ob eine Veränderung der Musashi-Expression in Brustkrebszellen einen Einfluss auf die Strahlenantwort des Mammakarzinoms hat.

Vor diesem Hintergrund war diese Arbeit als multidisziplinäre Kollaboration zwischen den Kliniken für Strahlentherapie – Radioonkologie (Leitung: Univ.-Prof. Dr. Hans Theodor Eich, Laborleitung: Prof. Dr. Burkhard Greve) sowie Frauenheilkunde und Geburtshilfe (Leitung: Univ.-Prof. Dr. Ludwig Kiesel; Laborleitung: Prof. Dr. Martin Götte) angelegt. Es wurde mit der etablierten tripelnegativen Brustkrebs-Zelllinie MDA-MB-231 gearbeitet.

Ergebnisse:

Vorarbeiten zum Zeitpunkt der Antragsstellung zeigten bereits, dass ein Knockdown beider Musashi-Proteine (MSI-1 und MSI-2) via small interfering RNAs (siRNAs) technisch erfolgreich umsetzbar war. Experimentell erfolgte jeweils der Vergleich zwischen Knockdown-Zellen und Kontrollzellen, die mit einer Kontroll-siRNA transfiziert worden waren.

Für die Arbeit wurden 3 Kernziele verfolgt:

1) Die Quantifizierung der Wirkung des Doppel-Knockdowns auf den notch-Signalweg
Im Rahmen der Arbeit konnte ich zeigen, dass der Doppel-Knockdown dazu führt, dass das Molekül mnumb (mammalian numb), das den notch-Signalweg hemmt, hochreguliert, und konsekutiv die mRNAs von notch1 und notch2, beide wichtige Teile des notch-Signalwegs, herunterreguliert wurden. Somit gelang der Nachweis, dass die Aktivität dieses wichtigen intrazellulären Signalwegs nach Knockdown der Musashi-Proteine abnahm. Alle Experimente in diesem Teil erfolgten via quantitativer Polymerasekettenreaktion (qPCR).

2) Die Wirkung des Knockdowns auf Brustkrebszellinvasivität und -metastasierung
In einem publizierten Manuskript der gynäkologischen Arbeitsgruppe (Ramirez Williams et al., 2019) konnte ein Zusammenhang zwischen der Expression der Musashi-Proteine und der LIF-Rezeptor-Expression (Leukemia inhibitory factor receptor) in der Endometriose gezeigt werden. Der LIF-Rezeptor ist als Suppressor von Metastasen bekannt (Johnson et al., 2016). In meiner Arbeit demonstrierte ich, dass der Musashi-Doppelknockdown zu einer verringerten Expression des LIF-Rezeptors führt. Das hatte in meinen Experimenten eine massiv gesteigerte Invasivität der Zellen zur Folge, was eigentlich überrascht angesichts einer geringeren Expression von Stammzellmarkern.

3) Die Wirkung des Knockdowns auf Brustkrebszell-Radioresistenz
In Kolonieformationsexperimenten, in denen ich Brustkrebszellen mit und ohne Doppelknockdown mit Röntgenstrahlen mit therapierelevanten Dosen von jeweils 2, 4 und 6 Gy bestrahlte, konnte ich eine deutliche Abnahme der Überlebens- und v. a. der Teilungsfähigkeit der Zellen mit Doppelknockdown beobachten. Das unterstreicht das postulierte therapeutische Potential des Knockdowns, da hier – zumindest in diesen in-vitro-Versuchen – ein deutlich besseres Ansprechen der Tumorzellen mit Doppelknockdown dokumentiert werden konnte.
Interessanterweise zeigte sich die mittels γH2AX gemessene Doppelstrangbruchrate nach Musashi-Knockdown nicht verändert. Das war einigermaßen überraschend, zeigte die Strahlung doch eine deutlich stärkere Wirkung in den Knockdown-Zellen. Die Strahlenwirkung wird primär über eine DNA-Schädigung und spezifisch über nicht oder unzureichend reparierte Doppelstrangbrüche vermittelt.
Eine gute Erklärung hierfür zeigte sich aber im finalen Experiment der Serie, das im Westernblot eine deutliche Herunterregulation des Proteins DNA-PKcs demonstrierte: Die γH2AX-Versuche beschreiben die Doppelstrangbruchrate nur indirekt. Direkt zeigen sie die γ-Phosphorylierung der Histone, die generell mit der Doppelstrangbruchrate korreliert. Allerdings wird diese Phosphorylierung durch das Protein DNA-PKcs vermittelt, das – wie in diesem letzten Versuch demonstriert – ja herunterreguliert ist. Somit ist es im Nachhinein durchaus nicht überraschend, dass in den γH2AX-Versuchen kein Unterschied sichtbar war.

Zusammenfassend ist es mir gelungen, die ersten Experimente zusammenzutragen, die die Wirkung von Musashi-Knockdown auf die Radiosensitivität des Brustkrebses zeigen. Im Wesentlichen haben die Versuche zu meiner großen Zufriedenheit sehr gut funktioniert. Ich freue mich, dass sich ein kohärentes Bild ergeben hat, das ich auch verschiedentlich präsentiert habe und präsentieren werde:

a) Vortrag auf dem Kongress der Deutschen Gesellschaft für Radioonkologie (DEGRO) im Juni 2019
Ich hatte die großartige Gelegenheit, erste Ergebnisse im Rahmen eines mündlichen Vortrags bereits im Juni auf dem Jahrestreffen der deutschen Radioonkologen vorzustellen. Damit konnte ich dort ein gutes Stück zur Sichtbarkeit der strahlenbiologischen Forschung innerhalb der Radioonkologie beitragen. Der Abstract wurde zudem in der internationalen, Pubmed gelisteten Fachzeitschrift "Strahlentherapie und Onkologie" zitierfähig abgedruckt.

b) Vortrag auf dem Retreat des Stammzellnetzwerks NRW im November 2019
Die dann weiterentwickelten Erkenntnisse habe ich in Form eines Abstracts zum Retreat des Stammzellnetzwerks NRW eingereicht. Der Abstract ist zu meiner großen Freude ebenfalls zum mündlichen Vortrag angenommen worden, sodass ich auf dem Treffen des Stammzellnetzwerks NRW vor etwa 100 Stammzellforschern aus unserem Bundesland als einer von nur zwei Referenten aus Münster einen Vortrag halten durfte. Hier habe ich mehrere wichtige Anstöße und Nachfragen und insgesamt sehr positives Feedback erhalten.

c) Finales Teilstück der Sichtbarkeit ist die wissenschaftliche Publikation der Ergebnisse
Letzter Part dieses wissenschaftlichen Projekts war die Veröffentlichung der Ergebnisse als Originalartikel in einer Fachzeitschrift. Im Rahmen der Projektbearbeitung ergab sich die Möglichkeit einer Kollaboration mit einer Forschungsgruppe aus Ägypten, die angeboten hat, weitere, über den ursprünglich angedachten Umfang hinausgehende Experimente, durchzuführen. In der Folge dieser internationalen Kooperation konnte das Projekt weiterentwickelt werden und wurde schließlich im "International Journal of Molecular Sciences" hochrangig publiziert.

Es kann unter folgender Zitation als Open-Access-Arbeit eingesehen werden:

Troschel FM, Minte A, Ismail YM, Kamal A, Abdullah MS, Ahmed SH, Deffner M, Kemper B, Kiesel L, Eich HT, Ibrahim SA, Götte M, Greve B. Knockdown of Musashi RNA binding proteins decreases radioresistance, but enhances cell motility and invasion in triple negative breast cancer. International Journal of Molecular Sciences 2020, 21, 2169; doi:10.3390/ijms21062169.

Link: https://www.mdpi.com/1422-0067/21/6/2169

Insgesamt war dies ein großartiges Projekt, was viel Spaß gemacht hat. Ich bedanke mich insbesondere beim SAFIR-Team, die sich mit viel Mühe und Verständnis darum gekümmert haben, mir diese Möglichkeit zu eröffnen.