Isolation und AFM-basierte ultrastrukturelle Charakterisierung pilzlicher Zellwände zur Evaluation zellwandschädigender Antimykotika
Antragsteller: Anton Zürbig
Fachbereich, Studienrichtung: FB 12 Chemie und Pharmazie, Institut für Pharmazeutische Biologie und Phytochemie (IPBP), Studiengang Pharmazie
Projekttitel: Isolation und AFM-basierte ultrastrukturelle Charakterisierung pilzlicher Zellwände zur Evaluation zellwandschädigender Antimykotika
Fördersumme: 4213,67 €
Kontakt: a.zuerbig@gmail.com
Projektbeschreibung:
Ziel des Forschungsprojekts war zum einen die Erarbeitung eines Isolationsprotokolls der Zellwand von Pilzzellen am Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae, zum anderen die Etablierung eines Testsystems zur Evaluation antimykotischer Leitstrukturen. Mit diesem Testsystem sollten neue potentiell die Pilzzellwand schädigende Substanzen in ihrer grundsätzlichen Wirksamkeit gegen S. cerevisiae charakterisiert werden können. Anschließend sollten die Zellwände von S. cerevisiae isoliert und der Wirkmechanismus der zellwandschädigenden Antimykotika über Veränderungen der Zellwand auf isolierter Ebene mittels Rasterkraftmikroskopie analysiert werden.
Die Erarbeitung des Isolationsprotokolls für die Zellwandbestandteile von Pilzzellen hat im Ergebnis bislang nicht reproduzierbar funktioniert. Die Chitinfilamente der Zellwand konnten zwar bei einzelnen Pilzzellen isoliert werden, bei einem Großteil der Pilzzellen war die Isolation jedoch nicht vollständig.
Dennoch ist die gewählte Kombination aus Arbeitsschritten sehr nahe an vollständig isolierte Pilzzellwände gekommen. So ist es mit der entwickelten Isolation zumindest möglich gewesen, filamentöse Bestandteile der Zellwand aufzureinigen und anschließend im Rasterkraft-mikroskop nanoskopisch aufzulösen (siehe Abb. 2).
Zur Charakterisierung der durch antimykotische Arzneistoffe induzierten Zellwandveränderungen wurden zusätzlich Zellwandbestandteile von S. cerevisiae mit den erarbeiteten Arbeitsschritten möglichst weit isoliert. Vorher wurden diese mit den zellwandschädigenden Arzneistoffen Nikkomycin und Caspofungin behandelt. Hierbei konnte man bereits Kanten und Brüche in der Zellwandstruktur, Verlust der Zellintegrität und auslaufende Zellen sehen. Zur genaueren Aufklärung des Wirkmechanismus und zur Quantifizierung der Wirkstärke wäre eine vollständige Isolation allerdings noch zielführender.
Andere Mitarbeiter des Arbeitskreises von Herrn PD Dr. Herrmann, in dem ich das Projekt durchgeführt habe, nehmen nun meine bisherigen Ergebnisse auf und versuchen, die Methode weiterzuentwickeln.
Die Entwicklung und vorläufige Validierung eines standardisierten Testsystems von Antimykotika an S. cerevisiae war erfolgreich. Im Laufe der Entwicklung konnte das Testsystem von großen Volumina (100 mL pro Ansatz) auf 96 Well-Plates (100 µL pro Ansatz) verkleinert werden, sodass der Ressourcenverbrauch sehr gering und eine Testung mit hohem Durchsatz, aber dennoch geringen Schwankungen und hoher Reproduzierbarkeit gewährleistet ist (siehe Abb. 4).
Das Testsystem wurde validiert, indem in Triplikaten bestimmte IC50-Werte von im Handel befindlichen Modellantimykotika mit aus der Literatur bekannten Referenzwerten verglichen wurden. Hierbei waren nur sehr geringe Abweichungen zu verzeichnen. Somit ist davon auszugehen, dass auch für neue, noch nicht getestete Arzneistoffkandidaten richtige Ergebnisse bei der Verwendung des Testsystems erzielt werden können.
Das Testsystem wurde dann weiterentwickelt für nicht in Wasser lösliche und stark flüchtige Substanzen, hierzu zählen z. B. ätherische Öle aus Pflanzen, die teilweise sehr hohe antimikrobielle Aktivitäten zeigen und deswegen sehr interessant für die Entwicklung neuer Antimykotika sind.
Der Arbeitskreis von Herrn Prof. Schmidt am Institut für Pharmazeutische Biologie und Phytochemie forscht an vernachlässigten Tropenkrankheiten. Bei einem Forschungsprojekt zum Mycetom, einer von Pilzen ausgelösten Erkrankung, stellte sich heraus, dass Sandelholzöl eine hohe Aktivität gegen die Erreger zeigt.
Zur Aufklärung des Wirkmechanismus von Sandelholzöl gegen Pilzzellen wird nun das im Zuge des Forschungsprojektes entwickelte Testsystem zur Charakterisierung antimykotischer Substanzen an S. cerevisiae verwendet.
Ebenso wird die Vermessung von ganzen Pilzzellen am Rasterkraftmikroskop hierfür herangezogen und weiterentwickelt (siehe Abb. 1).
Die Ergebnisse des Projekts habe ich am 10.06.2024 in einem Mitarbeiterseminar am Institut für Pharmazeutische Biologie und Phytochemie präsentiert. Darüber hinaus erfolgte eine Präsentation auf dem PharMSchool Symposium am 28.06.2024 im Rahmen eines Plenarvortrags. In der etwa 20-minütigen Diskussion nach dem Mitarbeiterseminar konnten einige Vorschläge und Methoden erarbeitet werden, mit denen die Versuche weiter optimiert und die Ergebnisse verfestigt werden könnten. Außerdem gab es Verbesserungsvorschläge für die Präsentation der Ergebnisse, die dann in der Präsentation auf dem Symposium umgesetzt wurden.
Insgesamt hat mir das Forschungsprojekt sehr viel Freude bereitet. So tiefe Einblicke in die Forschung zu erhalten, hat mich weiter in der Entscheidung bekräftigt, nach dem Abschluss des Studiums eine Promotion anzustreben und mein Interesse für die Wissenschaft nachhaltig geweckt.
Von besonderer Bedeutung für mich war vor allem die Zusammenarbeit mit den anderen Wissenschaftlern des Instituts, die sich im Zusammenhang mit meinem Projekt ergeben hat. Deswegen möchte ich mich sowohl meinem Mentor PD Dr. Fabian Herrmann als auch bei meinen PharMSchool Koordinatoren Dr. Katharina Possart und Dr. Stefan Esch sowie allen Doktoranden des Instituts für Pharmazeutische Biologie und Phytochemie herzlich bedanken.
Besonderer Dank gilt Herrn Prof. Schmidt und Stephan Seegers, die mit mir zusammen die Idee der Verwendung des Testsystems für ätherische Öle im Arbeitskreis von Prof. Schmidt entwickelt haben und das Testsystem nun selbst verwenden. Sie alle haben mich immer bei auftretenden Fragen unterstützt und mir Methoden so erklärt, dass ich nach und nach am Institut immer selbstständiger arbeiten konnte und nunmehr sogar mein Wissen zu Versuchen an Pilzzellen selbst an andere Mitarbeitende des Instituts weitergeben kann.
Auch bei Frau Dieks und Frau Ehlert möchte ich mich herzlich bedanken. Als Mitarbeiterinnen der Geschäftsstelle für Forschungsprojekte Studierender haben diese mich vor allem bei der Antragstellung und Koordination dieses Projekts unterstützt.
