Nichtlineare Mikroskopie

In der kohärenten Raman-Streuung werden durch mehrere Pulse passend gewählter Wellenlängen Vibrationsniveaus bestimmter Moleküle angeregt. Diese Vibrationsniveaus sind spezifisch für das jeweilige Molekül, das heißt, Proben können markerfrei und nicht-invasiv auf ihre chemische Zusammensetzung hin untersucht werden. Das macht die Raman-Mikroskopie zu einer beliebten Untersuchungsmethode in unterschiedlichsten Bereichen wie der Biologie, der Medizin oder der Pharmazie. Für die Anregung der Vibrationsniveaus müssen die Anregungspulse jedoch bestimmte Voraussetzungen erfüllen, wie etwa synchronisierte Repetitionsraten und einen breiten, durchstimmbaren Wellenlängenbereich. Dies stellt wiederum spezifische Anforderungen an eine Lichtquelle, die für die Raman-Mikroskopie genutzt werden soll. Zudem treten zusätzlich zu den gewünschten, kohärenten Raman-Prozessen oft auch parasitäre Prozesse auf, die zu einem störenden Untergrundsignal ohne chemische Information führen. Daher werden Mechanismen benötigt, um diese Untergrundsignale zu unterdrücken und die entstehenden Mikroskopiebilder so aussagekräftiger zu machen. Eine weitere Herausforderung ist die rauscharme Detektion des Signals, wofür optimierte Detektoren verwendet werden. 

Untergrundkorrektur für die stimulierte Raman-Streuung mittels Frequenzmodulation

Bei der stimulierten Raman-Streuung (SRS) werden Pulszüge mit zwei unterschiedlichen Wellenlängen genutzt, um Vibrationsniveaus bestimmter Moleküle anzuregen und damit ein Raman-Signal zu erzeugen. Dieses Signal tritt als kleine Intensitätsmodulation auf einem der Pulszüge auf und wird mittels eines Lock-in-Verstärkers detektiert. Neben diesem Prozess, der Informationen über die chemische Zusammensetzung der Probe trägt, können jedoch auch andere Prozesse ohne Beteiligung eines Vibrationsniveaus stattfinden, die eine Intensitätsmodulation der Pulse zur Folge haben und damit ein parasitäres Untergrundsignal erzeugen.

Zur Unterdrückung dieses parasitären Signals haben wir einen Mechanismus zur Frequenzmodulation der Pulse direkt in der Lichtquelle implementiert. Dabei wird einer der Pulszüge in seiner optischen Frequenz, d. h. in seiner Wellenlänge, bei der halben Pulswiederholrate moduliert, sodass nur jeder zweite Puls ein Raman-Signal erzeugt. Die andere Hälfte der Pulse kann aufgrund der nicht passend gewählten Wellenlänge kein Vibrationsniveau anregen, die wellenlängenunabhängigen parasitären Prozesse finden jedoch trotzdem statt. Durch die Detektion mit einem Lock-in-Verstärker werden so die Signale direkt voneinander subtrahiert, sodass eine Untergrundkorrektur in Echtzeit stattfindet. In unseren Arbeiten konnten wir eine Reduzierung des Untergrundes um bis zu einem Faktor von 8 erreichen. Dieses Verfahren bietet zudem den Vorteil, dass das resultierende Signal ein um 30% verringertes Rauschen aufweist als herkömmliche Verfahren, bei der die Untergrundkorrektur nachträglich digital durchgeführt wird. Zur Publikation von Kristin, Thomas und Nick.

Frequenzmodulation zur Unterdrückung nichtresonanten Untergrundes in der kohärenten anti-Stokes Raman-Streuung

Die kohärente anti-Stokes Raman-Streuung (CARS) beschreibt einen Prozess der kohärenten Raman-Streuung, bei dem das entstehende Signal eine kürzere Wellenlänge aufweist als die Anregungsstrahlen. Licht bei dieser Signalwellenlänge kann allerdings auch durch einen anderen Prozess entstehen, der unabhängig von den Vibrationsniveaus eines Moleküls abläuft und somit keine chemische Information beinhaltet, dies wird als nichtresonantes Signal bezeichnet. Da das nichtresonante Signal aufgrund seiner Wellenlänge nicht vom tatsächlichen CARS Signal unterschieden werden kann, führt dies zu einem Untergrundsignal in der Detektion.

Wir haben eine Methode zur Frequenzmodulation der Anregungsstrahlen direkt in der Lichtquelle implementiert, wodurch eine automatische Untergrundkorrektur bei der Detektion des Signals stattfindet. Bei der Frequenzmodulation wird einer der Anregungsstrahlen in seiner Wellenlänge moduliert, das heißt zwei aufeinanderfolgende Pulse weisen eine leicht unterschiedliche Wellenlänge auf. Dadurch wird mit dem einen Puls das resonante CARS Signal in Kombination mit dem nichtresonanten Signal erzeugt. Der andere Puls kann aufgrund seiner verschobenen Wellenlänge kein resonantes CARS Signal mehr erzeugen, das nichtresonante Signal entsteht jedoch trotzdem. Wird das gesamte Signal mit einem Lock-in-Verstärker detektiert, so werden die Signale zweier aufeinanderfolgender Pulse effektiv voneinander subtrahiert, sodass nur das resonante CARS Signal ohne Untergrund übrig bleibt. Durch dieses Verfahren kann also eine Untergrundkorrektur in Echtzeit durchgeführt werden, wodurch wir eine Kontrasterhöhung um einen Faktor von 18 erreicht haben sowie eine Verbesserung der Sensitivität um einen Faktor von 40. Zur Publikation von Thomas und Kristin.

 

Stimulierte Raman-Streuung mittels einer faserbasierten Lichtquelle mit schneller Wellenlängenverstimmbarkeit

Mit der stimulierten Raman-Streuung können in der Mikroskopie nicht nur vergrößerte Bilder von Proben, sondern auch deren chemische Zusammensetzung dargestellt werden. Dazu werden spezifische Vibrationsniveaus von Molekülen mithilfe von zwei Pulsen angeregt, deren Wellenlängendifferenz der Energie des Vibrationsniveaus entspricht. Um eine Probe umfassend zu untersuchen, werden daher Lichtquellen benötigt, die in ihrer Wellenlänge verstimmbar sind, um möglichst viele Vibrationsniveaus erreichen zu können.

Wir haben eine faserbasierte Lichtquelle genutzt, deren Wellenlänge innerhalb von nur 5 Millisekunden innerhalb eines weiten Bereichs geändert werden kann, wodurch viele Informationen über die Probe innerhalb wenig Zeit gewonnen werden können. Dies erlaubt die hyperspektrale Bildgebung unterschiedlichster Proben. Zudem haben wir die Wellenlängenverstimmbarkeit ausgenutzt, um zusätzlich zu Mikroskopiebildern auch Raman-Spektren unterschiedlicher Substanzen aufzunehmen. Da bei der stimulierten Raman-Streuung geringe Intensitätsmodulationen auf Pulsen mit hoher Intensität gemessen werden müssen, ist das Rauschverhalten einer Lichtquelle für die Raman-Mikroskopie ebenfalls von großer Bedeutung. Wir haben das Intensitätsrauschen der faserbasierten Lichtquelle charakterisiert, welches mit -153.7 dBc/Hz nur wenige Dezibel über dem fundamentalen Limit des Schrotrauschens liegt. Zur Publikation von Kristin und Thomas.