Forschung

Das Tätigkeitsfeld umfasst sowohl grundlagen- als auch anwendungsorientierte Forschungsarbeiten in der Lebensmittel- und Bioanalytik mittels massenspektrometrischer Kopplungstechniken und der hochauflösenden Massenspektrometrie.

Lipide

Lipide sind eine umfassende und bedeutende Gruppe von Biomolekülen. Sie spielen eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von biochemischen Prozessen im Organismus. Die Aufgaben der Lipide sind divers und erfordern somit eine große Strukturvielfalt unterschiedlichster Komplexität. Wichtige Methoden zur Analyse der Lipide sind die Flüssigchromatographie (LC) gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS). Neben der Trennung von Lipiden anhand ihrer hydrophoben Fettsäurereste mit Hilfe der Umkehrphasen (RP)-LC wird zur Trennung polarer Phospholipidklassen die Hydrophile Interaktions-Flüssigchromatographie (HILIC) eingesetzt. Die Phospholipidklassen werden hierbei nach ihrer klassenspezifischen polaren Kopfgruppe getrennt. Seit einiger Zeit setzen wir vermehrt die zweidimensionale (2D)-LC ein, um den Bereich der trennbaren Lipide zu erweitern. Vor allem online-Methoden, bei denen das Eluat der ersten Dimension beispielsweise durch einen sogenannten heart-cut direkt auf die zweite Dimension übertragen wird, erhöhen die Trennleistung, können aber auch zur Probenaufarbeitung eingesetzt werden. Eine interessante Kombination stellt hier die klassenbasierte Trennung polarer Phospholipide in erster Dimension mit Hilfe der HILIC dar. Die Klassen können anschließend im Detail durch eine Trennung mittels RP-LC in zweiter Dimension untersucht werden.

Cardiolipine (CL) sind besondere Vertreter der Phospholipide, welche in eukaryotischen Zellen lediglich in den Mitochondrien vorhanden sind. Sie liegen nahezu ausschließlich in der inneren Mitochondrienmembran (IMM) vor und dienen dort der Gewährleistung der allgemeinen Funktionalität dieses Zellorganells. Zudem spielen CL eine wichtige Rolle bei oder Apoptose. Einzigartig für diese Lipidklasse ist zudem die atypische dimere Struktur mit vier Fettsäureresten. CL enthalten zwei Phosphatidsäure (PA)-Einheiten, die durch Glycerin verbunden sind. Jede PA-Einheit enthält zwei teilweise unterschiedliche Fettsäureeinheiten mit Variationen in Kettenlänge und Sättigungsgrad, was zu einer hohen Strukturvielfalt führt. Zusätzlich ist die Zusammensetzung spezifisch für verschiedene Gewebe und Organismen. Beispielsweise bestehen CL aus Rinderherz hauptsächlich aus Linolsäureresten, während in Fischen auch höher ungesättigte Fettsäuren Bestandteil der CL sind. Neben den CL spielen auch ihre Oxidationsprodukte eine wichtige Rolle. Die Oxidation von CL durch Cytochrom c ist beispielsweise ein entscheidender Schritt für die intrinsische Apoptose durch Freisetzung von pro-apoptotischen Faktoren aus dem Mitochondrium ins Zytoplasma. Häufig ist auch die Bildung von Mono-Lyso-Cardiolipinen (MLCL), also CL mit Verlust einer Fettsäure, der Grund für die Destabilisierung der IMM und folglich die Dysfunktion der oxidativen Phosphorylierung, was zu einer erhöhten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) führt. All dies kann zu einer geringeren CL-Konzentration in der IMM führen und steht so im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten wie Diabetes, Herzversagen und Parkinson.

Für den Nachweis und die Profilanalyse von CL und deren (oxidierten) Metaboliten durch z.B. ROS sind moderne Kopplungstechniken der LC-HRMS in Kombination mit software-unterstützter Datenverarbeitung unerlässlich. Die Verwendung von 2D-LC-Systemen ermöglicht es zudem koeluierende Spezies durch ein von der ersten Dimension abweichendes Trennprinzip zu trennen. Neben der häufig verwendeten Normalphasen (NP)- und RP-Chromatographie wird die HILIC eingesetzt, so auch für die Trennung von CL.

Doppelbindungspositionsbestimmung in Lipiden

Lipide umfassen eine Gruppe von Biomolekülen, die eine große Variation an chemischen Strukturen aufweisen und verschiedenste Aufgaben und Funktionen in unterschiedlichsten Lebensformen besitzen. Doppelbindungen haben Einfluss auf die chemischen, biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften der Lipide. Die Lokalisation von Doppelbindungspositionen gilt als Herausforderung hinsichtlich der Komplexität der Strukturen bzw. der vorliegenden Gemische. Für entsprechende Zuordnung der Positionen werden unterschiedlichste Ansätze verfolgt. Ein vielversprechender Ansatz basiert auf der photochemischen Paternò-Büchi-Reaktion. Nach erfolgter UV Bestrahlung kommt es hier zu einer Bindung von aktiviertem Aceton an die Doppelbindung. Der ausgebildete Oxetan-Ring ermöglicht eine gezielte Spaltung und die Generierung von diagnostischen massenspektrometrischen Fragment Ionen. Wird die online-Reaktion zusätzlich mit der Flüssigkeitschromatographie gekoppelt, können weitere Informationen über die Struktur der Lipide gewonnen werden. Dies ermöglicht unter anderem eine Unterscheidung von Strukturisomeren. Des Weiteren führt die Kopplung zu einer Aufnahme von Massenspektren mit reduzierter Komplexität und einer Minderung von Matrixeffekten.

Softwareentwicklung zur Lipididentifizierung

Moderne Kopplungstechniken von chromatographischen Trennmethoden mit der hochauflösenden Massenspektrometrie ermöglichen die Erfassung der Lipide von komplexen biologischen Proben in sehr kurzer Analysezeit. Die Prozessierung der dabei generierten mehrdimensionalen Datensätze mit anschließender Identifizierung von Lipiden ist dabei der geschwindigkeitsbeistimmende Schritt. Daher werden neue Algorithmen und Datenbanken zur Identifizierung diverser Lipidklassen entwickelt. Die Entwicklungen werden in die Open-Source-Software MZmine 2 integriert und so allen Anwendern zur Verfügung gestellt. Ein besonderer Fokus liegt dabei auf Glykolipiden, MS/MS-Datenbanken, sowie der Identifizierung von Oxidations- und Derivatisierungsprodukten. Als unterstützendes graphisches Auswertungstool dient ein auf dem Kendrick-Massendefekt basierendes Visualisierungsmodul, welches chromatographische Informationen in einer dritten Dimension darstellt.

Biotenside

In den letzten Jahren kam vermehrt eine Diskussion über verbleibende Erdölreserven und die nachhaltige Nutzung von Rohstoffen auf. Für die Biokatalyse bieten nachwachsende Rohstoffe eine vielversprechende Alternative für die Produktion von chemischen und biotechnologischen Produkten. Im Fall von Tensiden, die vielfältige Anwendungen in Detergenzien, Pharmazeutika, Kosmetika sowie in der Nahrungsmittelindustrie finden, basiert die Mehrheit nach wie vor auf petrochemischen Herstellungsprozessen. Biotenside dagegen, wie zum Beispiel Rhamnolipide oder Liamocine aus der Klasse der Glykolipide, zeigen eine hohe Wirkeffizienz bei gleichzeitig guter biologischer Abbaubarkeit und geringer Toxizität.

Rhamnolipide werden in erster Linie durch Pseudomonas-Spezies als Sekundärmetabolite gebildet und zeigen eine große strukturelle Vielfalt. Bisher liegt der Schwerpunkt auf der Produktion und weitaus weniger auf der Strukturaufklärung und Analytik. Basierend auf den analytischen Techniken der Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie (LC/MS), der Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) und der Kapillar-Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS) werden diese massenspektrometrischen Kopplungstechniken zur Untersuchung von Biotensiden eingesetzt.

Liamocine, die von Aureobasidium pullulans gebildet werden, weisen eine antibakterielle Aktivität gegen Steptococcus Spezies auf. Basierend auf der LC/MS sowie der Tandem-MS sollen analytische Methoden zur Trennung und Strukturaufklärung der Biotenside entwickelt werden.
Beide analytische Fragestellungen werden u.a. in Kooperation mit Prof. Dr. Lars M. Blank und Dr. Till Tiso (Institut für Angewandte Mikrobiologie, RWTH Aachen) bearbeitet.

Analytik von Metaboliten

Zur Identifizierung und Quantifizierung verschiedenster Metaboliten wird unter anderem die Kapillar-Ionenchromatographie (Cap-IC) in Kombination mit der Leitfähigkeitsdetektion sowie der Massenspektrometrie (MS) eingesetzt. Analysiert werden hiermit beispielsweise kurzkettige Fettsäuren (SCFA, engl. short chain fatty acids) und Oxalsäure. Die entwickelten Methoden werden sowohl auf verschiedene biologische als auch medizinische Fragestellungen angewendet. So wurden bisher unter anderem Urin und Faecesproben von Mäusen sowie Arabidopsis thaliana-Proben erfolgreich mithilfe der Cap-IC analysiert.

Auf Basis der Hydrophilen Interaktionsflüssigchromatographie (HILIC) und der Ionenaustauschchromatographie (IC) werden zielgerichtete chromatographische Trennmethoden zur Identifizierung und Quantifizierung polarer Metaboliten mit der Massenspektrometrie gekoppelt.

Ein Bestandteil dieser analytischen Fragestellungen sind Pyoverdine. Die grün fluoreszierenden Moleküle werden von Pseudomonas Bakterien zur Eisenbeschaffung synthetisiert. Aufgrund ihrer hohen Affinität zum Eisen(III) können diese Siderophore der Umgebung gebundenes Eisen entziehen und sind somit von großem Interesse im medizinischen und biologischen Bereich.
Aufgrund der charakteristischen Struktur bestehend aus einer chromophoren Einheit geknüpft an eine Acylseitenkette und einer Peptidsequenz sowie des polaren Charakters lassen sich die Pyoverdine mittels HILIC, hochauflösender Massenspektrometrie und Fragmentierungsexperimenten charakterisieren. Ziel ist hierbei die Strukturaufklärung bisher unbekannter Verbindungen. Zusätzliche Informationen über die Zusammensetzung der Peptidkette werden mittels isotopenmarkierten Probenmaterial sowie durch Hydrolyse-Experimente erhalten.

Dielectric barrier discharge Ionisierung

Die Bestimmung von Pestizid-Rückständen in pflanzlichen Lebensmitteln ist von großer Bedeutung für den Verbraucher- und Gesundheitsschutz. Mehr als 1000 verschiedene Wirkstoffe kommen weltweit allein im Bereich des Pflanzenanbaus zum Einsatz. Die Persistenz der Pestizide stellt ein gesundheitliches Gefährdungs-potential dar.
Darüber hinaus werden weitere organische Substanzen kontinuierlich in die Umwelt freigesetzt (Tenside, Hormone, Pharmazeutika, Körperpflege-produkte, etc.), die als sog. „emerging contaminants“ bezeichnet werden und in Zukunft zu gesundheitlichen Beeinträchtigungen führen können.

Demzufolge sind zur Rückstandsanalytik in Lebensmitteln und des Screenings nach „emerging contaminants“ in der Umwelt Multikomponentenmethoden erforderlich, die ein möglichst breites Analytspektrum abdecken. Vor allem instrumentelle Kopplungen aus effizienten Trenn- und hochselektiven massenspektrometrischen Detektionsverfahren sind in der Lage, diesen Erfordernissen gerecht zu werden. Etabliert hat sich in der Lebensmittelanalytik in den letzten Jahren immer mehr die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)-Kopplung neben der bewährten Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS). Es gibt aber bislang keine universelle Ionisierungsmethode, die sowohl unpolare als auch polare Substanzen gleichermaßen effizient ionisiert. Demzufolge sollen alternative Ionisierungstechniken entwickelt und eingesetzt werden. Ein vielversprechender Ansatz sind Mikroplasma-basierte Entladungen, die in der Arbeitsgruppe von PD Dr. Joachim Franzke (Leibniz-Institut für Analytische Wissenschaften – ISAS – e.V., Dortmund) entwickelt werden. In Kooperation werden diese Techniken charakterisiert und zur Anwendung in der Spurenanalyse von Schadstoffen gebracht.